文章中使用的单细胞建库平台为墨卓生物的MobiNova®-100，该平台的亮点之一：6 min完成核酸捕获，最大程度减少RNA降解。借助该平台，经流式分选的细胞依然能被高效的捕获，同时获得高质量的数据，墨卓平台的省时特性给予该应用场景以充分保障。

慢性肝损伤引起的肝纤维化和肝硬化是世界重大健康疾病之一。肝纤维化是以细胞外基质（EMC）过度沉积为特征的慢性肝损伤结果，能形成有利于肝癌发展的微环境。目前针对纤维化的临床干预和治疗有限，以细胞治疗为代表的替代治疗方案开发成为重要的方向之一。根据研究显示，单核吞噬细胞巨噬细胞在肝纤维化的进展和消退中具有双重作用，以巨噬细胞为导向的细胞治疗已经在小鼠肝纤维化模型和临床试验中开展测试。

1.uPAR 为靶标的 CAR-Ms技术开发

细胞衰老和肝星状细胞增殖减少可能在 ECM 降解中发挥着作用。之前的一项研究发现uPAR是衰老过程中广泛诱导的细胞表面蛋白，并证明抗uPAR 的CAR-T细胞对肝纤维化具有活性。该研究在更大规模的肝纤维化或肝硬化患者群体中证实了这一发现，表明uPAR是一种在肝纤维化过程中过度表达的细胞表面蛋白，是一种潜在的治疗干预靶标。

接下来，该研究构建了由抗小鼠uPAR的第一代CAR，并转导了小鼠骨髓源性巨噬细胞 (BMDM) CAR-Ms。腺病毒感染后，通过流式细胞术测量了巨噬细胞 CAR 表达（图 1A和1B），结果表明 CAR-Ms 在体外具有依赖 uPAR 的吞噬作用。

图 1

2.CAR-Ms技术可以改善肝功能

1）CAR-Ms 减轻毒素引起的肝纤维化

该研究测定了 uPAR CAR-Ms 在毒素（反复注射 CCl4）诱导的纤维化小鼠体内的抗纤维化功效。结果表明，与 PBS 组相比，BMDMs 能显著减少 ECM 沉积，这与已发表的结果一致。与靶向活性和治疗效果相一致的是，接受 CAR-Ms 治疗的小鼠血清中肝脏酶 ALT 水平降低，表明促炎性衰老造血干细胞被有效清除，肝损伤减轻。天狼星红染色，α-SMA 以及 desmin 分析进一步证实，反复注射 CCl4 组的肝纤维化有所缓解（图2）。

图 2

2）CAR-Ms 定位于肝脏并在体内发挥功能

为了评估uPAR CAR-Ms在体内的疗效，用抗uPAR染色了由CCl4诱导的纤维化小鼠经CAR-Ms处理后的肝脏切片（图3A）。组织学分析表明，输注了uPAR CAR-Ms的纤维化小鼠肝脏中的uPAR阳性区域明显减少（图3B）。实验证明uPAR CAR-Ms 可在体内消除靶细胞，从而缓解肝纤维化。

图3

3）CAR-Ms 改善纤维化小鼠的肝功能

由于被招募的巨噬细胞在协调肝脏修复和再生方面发挥着至关重要的作用，猜测可以使用表达 CAR 的外源性体外分化巨噬细胞来改善肝功能。因此，该研究试图评估 uPAR CAR-Ms 能否恢复纤维化小鼠的肝功能。通过对 CCl4 诱导的肝纤维化小鼠模型研究，与对照组相比，接受 BMDMs、Mock-BMDMs 或 uPAR CAR-Ms 治疗的纤维化小鼠肝细胞生长因子（Hgf）的 mRNA 水平有显著增加（图 4A）。此外，与其他组相比，CAR-Ms 受体小鼠的血清白蛋白也有所增加（图 4B）。因此，在实验结束时用 CAR-Ms 处理会诱导肝细胞增殖，Ki67 表达显示了这一点（图 4C）。这些结果表明，CAR-Ms疗法能促进纤维化小鼠肝细胞的增殖和肝功能的恢复。

图4

3.CAR-Ms技术的机制解析

为了进一步了解 CAR-Ms 诱导的细胞变化，该研究对从注射生理盐水、BMDMs 或 CAR-Ms 的纤维化小鼠肝脏中收集的 FACS 分选单细胞进行了 RNA-seq（图 5A）。细胞输注七天后，用流式细胞术分离出所有白细胞（CD45⁺），并对它们进行 MOBINOVA-100 单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）（图 5A）。对 9,394 个白细胞进行了 scRNA-seq 分析，确定了不同的白细胞群，包括 Ly6c^hi 巨噬细胞、Ly6c^lo 巨噬细胞、pDCs、cDC2s、cDC1s、ILC1s、中性粒细胞、循环 T 细胞、NK 细胞、B 细胞和 T 细胞（图 5B）。对小鼠肝脏 T 细胞进行亚聚类分析，发现了六个定义明确的亚群，这些亚群是根据已发表的特征和细胞标记进行注释的（图 5C）。对照组小鼠和接受 CAR-Ms 治疗的小鼠的 T 细胞区系的整体组织显示出惊人的差异。scRNA-seq 数据显示，接受 CAR-Ms 治疗的纤维化小鼠细胞毒性 CD8⁺T 细胞显著增加（图 5D）。这些数据表明循环 T 细胞发生了显著变化，这些细胞被定性为具有细胞毒性的循环效应 CD8⁺T 细胞。总之，scRNA-seq 分析证实了CAR-Ms 疗法不仅通过直接消灭 uPAR+ 肝星状细胞，还通过改善肝脏微环境和产生疫苗效应来减轻肝纤维化。

图5

CAR-Ms 的过继转移导致肝纤维化小鼠模型中肝纤维化显著减少和功能恢复。CAR-Ms 调节肝脏免疫微环境以募集和修饰内源性免疫细胞的活化以驱动纤维化的消退。这些CAR-M能够募集抗原并将其呈递给T细胞，并产生特异性的抗纤维化T细胞反应，以减少小鼠的成纤维细胞和肝纤维化。总之，该研究证明了使用靶向uPAR的CAR 巨噬细胞 (CAR-Ms)可以减轻肝纤维化和肝硬化，论证了使用巨噬细胞作为CAR技术平台的潜力，为肝纤维化患者提供更高效的治疗策略，值得进一步临床验证。