算法概览

mobivision chip可以用于分析MobiNova平台下机的单细胞表观组ChIP数据，关键分析步骤如下图所示:

Barcode矫正

MobiNova平台产生的ChIP文库示意图如下：

墨卓scChIP fastq数据为双端测序，Read 1从5‘端到3’端分别为cell barcode，umi，MEC固定序列，insertDNA。mobivision chip在处理输入的fastq数据时，首先会对Read1中的cell barcode进行矫正。若cell barcode存在于mobivision 内置的whitelist中，则该read 含有有效的cell barcode，可进行下一步分析。若cell barcode不存在于whitelist中，则该read无效，丢弃。cell barcode在与whitelist中的barcode序列进行比对时，每个10个碱基，hamming距离<=1即可通过。在输出的valid reads中，read 1序列对应的cell barcode为矫正后的cell barcode。cell barcode及UMI序列，存于read id，而非read sequence。

对于cell barcode通过纠正的reads，还需进一步去除adaptor。Read 1需要去除其3'端的MEB序列及其5‘端的MEC序列的反向互补序列，Read 2 需要去除其3’端的MEC序列，adaptor trimming允许的错配率为0.1。经过trimming处理后，得到valid and clean fastq，可用于后续比对。

Alignment

mobivision chip比对使用了内置的bowtie2软件，为双端比对，输出.bam结果比对文件，即包含mapped reads，也包含unmapped reads。

对于比对得到的bam文件，作进一步过滤去重处理，仅保留双端比对，且MapQ >= 30的alignments，仅保留长度 <= 2000bp的alignments，根据比对信息中的cell barcode、染色体名、比对起点和比对终点，去除重复的片段，得到过滤去重后的filtered.bed文件，并利用该文件生成可视化的bw文件。若该样本为双物种样本，则每个物种各生成一个对应的bw文件。

Peaks Calling and Annotation

使用mobivision chip内置的macs2软件，以去重过滤处理后的filtered.bed进行peak calling。若不指定peaks类型，则默认使用narrow peak type，若需call broad peak，则需指定--peaktypebroad。若指定了--control，则call peak时，以IgG数据作为control，矫正背景噪音。最终输出以.narrowPeak或.broadPeak为后缀的peaks文件。对于得到的peaks文件，进行注释，注释原则如下：

启动子区（promoter region）是指转录起始位点（transcript start site）上游1000bp，到下游100bp的区间（-1kb,+100）;

distal peak是指该peak距离离它最近的TSS不超过200kb，且其不位于启动子区域；

distal peak又指peak与某一转录本有重合，但是，其既不属于上述情况的promoter region，也不属于上述情况的distal peak，这种peak也称为distal peak；

除以上三种情况，其他peak均称为intergenic peak。

Valid Fragments

Valid Fragments即fragments in peaks，定义为fragment有1个碱基落于peak内，即判定为fragmentsInPeaks。用该数据作为输入，进行cell calling。

Cell Calling

mobivision chip目前过滤细胞采用动态阈值策略进行细胞barcode筛选：首先将所有barcode按其落入peak区域的片段数降序排列，取期望细胞数N（默认3000）的95分位数位置（即第2850位当N=3000时）对应的片段数作为m值；然后将m/10设为判定阈值，所有片段数超过该阈值的barcode均被识别为有效细胞。例如当N=3000且m=20000时，阈值设为2000，此时所有片段数超过2000的barcode将被保留（图示案例筛选得到9000个细胞）。该方法的优势在于能根据数据特征自动调整筛选标准，确保不同规模数据集都能获得可靠的细胞识别结果。

Report Generation

根据上述分析结果及中间数据，对本次样本分析进行汇总，包括sequencing、mapping、cell、targeting、t-SNE Projection五个板块。

1. Sequencing: 主要对输入文库的测序质量进行统计；

2. Mapping: 对文库的比对结果进行统计；

3. Cell：对最终call cell得到的结果矩阵进行统计；

4. Targeting: 对应fragments及peaks的注释信息进行统计；

5. t-SNE Projection：使用LSA降维，t-SNE映射处理，Louvain聚类。